在藥物研發(fā)與臨床評價中，精準定量藥物濃度是評估藥物療效和安全性的重要環(huán)節(jié)。隨著生物技術的飛速發(fā)展，生物藥（如單抗、多肽、寡核苷酸、小核酸、PROTAC等）和小分子化藥的生物分析需求日益復雜，液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）憑借其高靈敏度、高特異性，已成為生物分析領域不可或缺的工具。作為覆蓋臨床前到臨床全鏈條的PK/PD研究平臺，陽光德美依托國際領先的質譜分析平臺及符合GLP/GCP要求的實驗室體系，致力于為創(chuàng)新藥物提供精準PK/PD研究服務。本文將從技術原理與優(yōu)勢、技術挑戰(zhàn)、應用案例及平臺優(yōu)勢五方面，解析LC-MS/MS技術如何實現(xiàn)藥物濃度的精準定量。
1.原理
液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）是一種結合了液相色譜（LC）高效分離能力和串聯(lián)質譜（MS/MS）高靈敏度檢測能力的分析技術。液相色譜通過流動相將復雜樣品中的各組分分離，隨后進入質譜儀進行檢測。質譜儀通過電噴霧離子化源的電離技術對樣品進行霧化電離，根據(jù)質荷比（m/z）對離子進行分析，從而實現(xiàn)對目標化合物的定性和定量分析。
2.優(yōu)勢：
（1）高靈敏度與高特異性
LC-MS/MS技術能夠在復雜生物基質中檢測到極低濃度的目標藥物，能夠檢測到ng、pg，甚至fg級別。這種高靈敏度使其成為檢測低豐度藥物及其代謝產物的理想選擇。同時質譜儀的高特異性可以有效排除基質干擾，確保檢測結果的準確性。
（2）寬線性范圍與高準確度
LC-MS/MS技術具有寬線性范圍，能夠覆蓋從低濃度到高濃度的藥物濃度范圍。這意味著在一次分析中，可以同時檢測到藥物的低劑量和高劑量水平。另外通過使用同位素內標，LC-MS/MS能夠顯著提高定量的準確度。
（3）快速分析與高通量
LC-MS/MS技術能夠在短時間內完成復雜樣品的分析。LC-MS/MS的分析時間較短，且能夠同時采集多個分析物的數(shù)據(jù)。這使得其在大規(guī)模臨床試驗和藥物研發(fā)中具有顯著的效率優(yōu)勢。
1.基質效應
基質效應是LC-MS/MS技術在生物分析中面臨的主要挑戰(zhàn)之一。基質效應是指生物基質中的成分對分析物響應的影響。生物樣品中的內源性物質可能會干擾目標藥物的離子化過程，導致檢測結果的偏差。為解決這一問題，通常采用內標法和基質匹配校準曲線。內標法通過添加已知濃度的內標物，校正基質效應的影響。基質匹配校準曲線則通過用相同比例基質制備標準曲線，確保定量的準確性。
2.方法開發(fā)
LC-MS/MS方法的開發(fā)是一個復雜的過程。方法開發(fā)需要考慮樣品前處理方法、色譜條件、質譜參數(shù)等多個因素。LC-MS/MS方法開發(fā)需兼顧靈敏度、特異性與通量，其核心挑戰(zhàn)在于如何優(yōu)化前處理方法與質譜參數(shù)。
(1). 樣品前處理策略
化藥：采用蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取（SPE）富集目標化合物。例如，疏水性藥物可通過增加有機相比例提升回收率。內源性藥物：常用的替代基質法、替代分析物法，再結合化合物的極性與靈敏度的要求，采取不同的處理方法，減少其他內源性化合物的干擾，達到實驗的目的。多肽藥物：肽類生物分析通常采用的樣品預處理技術主要有固相萃取、蛋白質沉淀和免疫親和提取。而蛋白沉淀和固相萃取的結合使用，對某些多肽分析物的提取回收率有很大的幫助。抗體藥物：通過酶切生成特征性肽段（替代肽段），結合親和富集或直接沉淀法去除基質干擾。
核酸藥物：液液萃取法和固相萃取法是核酸類藥物生物樣品制備中使用最廣泛的方法，最常見的液液萃取方法是使用苯酚-氯仿提取或者是在此基礎上的改進，而最常見的固相萃取方法采用與色譜分離中相似的緩沖系統(tǒng)。液液萃取和固相萃取的組合也是測定寡核苷酸的一種方法。核酸藥物的樣本前處理中非特異性吸附是核酸類分子靈敏度降低的一個更重要原因。因此，在該方法中盡量減少樣品轉移步驟，避免樣品損失也是前處理過程中需要解決的問題。
(2). 質譜參數(shù)優(yōu)化
可以采用多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式提升靈敏度。MRM是一種常用于三重四極桿質譜（Triple Quadrupole MS）的多重反應監(jiān)測技術，適用于同時定量多個目標化合物。它通過選擇母離子和子離子對的反應進行監(jiān)測，具有更高的選擇性。在MRM模式下，質譜儀首先選擇目標分子的母離子（Parent Ion），然后通過碰撞誘導解離生成子離子（Product Ion），并在第三個四極桿中選擇并監(jiān)測這些子離子的信號。可以同時監(jiān)測多個目標物質的母離子和其對應的子離子對。該模式具有高靈敏度和選擇性，能夠同時監(jiān)測多個目標物質。可以有效抑制背景干擾。但需要預先知道目標物質的母離子和子離子的反應信息。
3. 方法驗證
在生物分析領域，方法驗證是確保檢測結果科學性、準確性和可靠性的關鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)ICH M10指導原則，色譜法（如LC-MS/MS）的方法驗證需要涵蓋多個關鍵參數(shù)，以全面評估分析方法的性能。以下是這些參數(shù)的詳細描述：
（1） 線性范圍
線性范圍是校準曲線能夠準確反映分析物濃度的區(qū)間，由定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）決定。校準曲線應包括至少6個濃度水平的校正標樣，覆蓋從LLOQ到ULOQ的范圍。在校準曲線的每個濃度水平，回算濃度應在標示值的±15%以內（LLOQ為±20%），且至少75%的校正標樣需符合標準。
（2） 精密度與準確度
精密度和準確度是評估分析方法重復性和準確性的重要指標。精密度通過批內和批間變異系數(shù)（%CV）來衡量，準確度則通過質控樣品的回算濃度與標示值的偏差來評估。準確度應在標示值的±15%以內，精密度不應超過15%（LLOQ準確度應在標示值的±20%以內，精密度不應超過20%）。
（3） 選擇性與特異性
選擇性是指分析方法在復雜生物基質中區(qū)分和測定分析物的能力。驗證時需使用至少6個不同來源的空白基質，確保在分析物保留時間處無顯著干擾。對于高脂和溶血基質，也需進行選擇性評估，以模擬實際研究中可能遇到的樣品條件。
（4） 基質效應
驗證時需使用至少6個不同來源的常規(guī)基質、至少1個來源溶血基質和至少1個來源的高脂基質，分別制備低濃度和高濃度質控樣品，評估其準確度和精密度。每個來源的基質中，準確度應在標示濃度的±15%以內，精密度不應超過15%。
（5） 提取回收率
提取回收率用于評估樣品處理過程中分析物的損失情況。通過比較處理后的樣品與未處理樣品的響應值，計算回收率。該參數(shù)有助于優(yōu)化樣品處理方法，確保方法的可靠性和重現(xiàn)性。
（6） 稀釋可靠性
稀釋可靠性是評估樣品稀釋過程對檢測結果影響的參數(shù)。驗證時需使用與質控樣品相同來源的空白基質進行稀釋，確保稀釋后的樣品濃度在校準曲線范圍內被準確測定。稀釋質控樣品的準確度應在標示值的±15%以內，精密度不超過15%。
（7） 穩(wěn)定性
穩(wěn)定性驗證包括儲備液、工作液、基質樣品和處理后樣品的穩(wěn)定性。需在實際儲存條件下考察分析物的穩(wěn)定性，確保樣品在采集、轉移、處理和儲存過程中濃度不變。
（8） 重進樣重現(xiàn)性
重進樣重現(xiàn)性用于評估樣品在儲存和重新進樣過程中的穩(wěn)定性。通過重復測定儲存后的質控樣品，評估其精密度和準確度，以確定處理后樣品的重進樣的可行性。陽光德美實驗室嚴格遵循ICH M10指導原則，對LC-MS/MS進行全面的方法驗證。通過科學嚴謹?shù)尿炞C流程，實驗室確保每個分析方法的線性范圍、精密度與準確度、選擇性與特異性、基質效應、提取回收率、稀釋可靠性、穩(wěn)定性和重進樣重現(xiàn)性均達到國際標準，從而為客戶提供高質量、精準的檢測服務。
LC-MS/MS技術廣泛應用于生物分析、藥物代謝等領域，尤其在藥物濃度定量方面具有顯著優(yōu)勢。陽光德美憑借豐富的實戰(zhàn)經驗，為各類藥物提供定制化的解決方案。
1. 小分子藥物的PK研究及代謝產物鑒定
（1）磷酸森格列汀片是盛世泰科自主研發(fā)的1類創(chuàng)新藥，陽光德美快速高效地完成了PK及代謝產物鑒定研究工作，助力磷酸森格列汀片獲批上市。森格列汀多個代謝產物互為同分異構體是其代謝的一大特點，同時也增加了分析的難度。健康受試者口服森格列汀后，在血漿、尿液、糞便樣本中，除原型藥外，共鑒定了11個代謝產物。陽光德美首先采用高效液相-三重四極串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS），通過優(yōu)化色譜條件，分離了4組互為同分異構體的代謝產物。然后運用具有高分辨率、高靈敏、高準確度等特點的四極桿-飛行時間質譜（AB TRIPLE TOFTM 5600，Q-TOF），根據(jù)采集的原型藥物及其代謝產物的精確質量數(shù)的數(shù)據(jù)確定分子式；通過質譜的碎片信息解析質譜的裂解途徑，進而預測結構。我們憑借著豐富的質譜解析經驗，推測了森格列汀在人體內主要的代謝途徑，為解釋森格列汀藥效研究和安全性評價的物質基礎提供科學依據(jù)。更多內容見《喜報：陽光德美PK/PD團隊助力1類新藥磷酸森格列汀片獲批上市》。（2）鹽酸凱普拉生片是柯菲平自主研發(fā)的1類新藥（曾用名：鹽酸柯諾拉贊片，H008），已正式獲批上市，該創(chuàng)新藥為鉀離子競爭性酸阻滯劑（P-CAB）,用于十二指腸潰瘍和反流性食管炎的治療。陽光德美有幸參與該藥物的Ia期、Ib期、Ic期、III期臨床研究生物樣品分析、代謝產物鑒定和DDI研究，并高效地推進了申報進程。陽光德美與柯菲平在長期的合作中，不斷溝通磨合，以更高質高效的研發(fā)服務，滿足柯菲平鹽酸凱普拉生片項目申報上市需求。在鹽酸凱普拉生片的研發(fā)過程中，陽光德美結合豐富的工作經驗與技術能力，開發(fā)并驗證了具有高靈敏度、高特異性的高效液相色譜-質譜/質譜（HPLC-MS/MS，Nexera HPLC-TRIPLE QUAD 5500）定量分析方法，同時對多種基質（人血漿、糞便、尿液）中凱普拉生及多種代謝產物進行分析。定量分析方法靈敏度高，定量下限低，分離度好，且用血量少，處理方法簡便、快捷，分析時間短。同時還采用QTOF高效地完成了代謝產物鑒定工作。III期群體藥代動力學共涉及50家醫(yī)院臨床研究中心，并涉及2種疾病的患者（反流性食管炎和十二指腸胃炎）。陽光德美同時對接多家醫(yī)院，高效且順利地完成了物資寄送與樣品接收。更多內容見《喜報：陽光德美PK/PD團隊助力盛格列汀片及鹽酸凱普拉生片取得重大進展》。
2. 生物藥的生物分析
（1）多肽藥物的藥代動力學研究
YKYY017霧化吸入劑是一款吸入型創(chuàng)新多肽，陽光德美參與并順利高效地完成了YKYY017的藥代動力學研究和免疫原性研究，為這一重要藥物的研發(fā)進程邁出了堅實的步伐，助力YKYY017項目順利進入臨床III期。YKYY017作為鼻噴霧吸入制劑，血漿中藥物濃度的檢測極具挑戰(zhàn)。陽光德美采用液質聯(lián)用儀（Triple Quad 7500）開發(fā)并驗證了高特異性、高靈敏度的定量分析方法檢測血漿和尿液中的藥物濃度，應用液液萃取法進行樣品前處理，操作簡單、節(jié)約成本；同時，引入內洗外洗加強洗方法及特殊的洗脫試劑解決了殘留問題。最終實現(xiàn)血漿方法靈敏度達10 pg/mL，尿液方法靈敏度200 pg/mL，從而實現(xiàn)首劑量即可獲得完整PK血藥濃度曲線的結果，為臨床研究提供了全面、完整的數(shù)據(jù)支持。更多內容見《陽光德美助力悅康藥業(yè)吸入型創(chuàng)新多肽YKYY017項目順利進入臨床III期》。
（2）寡核苷酸藥物
注射用CT102是悅康藥業(yè)研發(fā)的國內首個抗肝癌ASO藥物，陽光德美借助其大小分子PK/PD研究綜合性平臺的優(yōu)勢，攻克重重困難，成功推動了其藥代動力學研究，建立了可以同時檢測臨床血、尿、糞樣品中原型藥及其代謝產物的生物分析方法，同時進行免疫原性研究及PD指標的研究，并成功將方法應用于寡核苷酸藥物I期及IIa期臨床研究，為II期研究采血點的調整、劑量的調整提供了科學依據(jù)。更多內容見《生物分析專欄|寡核苷酸藥物的藥代動力學及其生物分析》。
1. 全鏈條服務能力
陽光德美是一家集大/小分子藥物分析為一體的、覆蓋臨床前到臨床全鏈條的PK/PD研究平臺和生物分析平臺。陽光德美擁有符合GLP、GCP要求的生物分析實驗室、P2級細胞實驗室和PCR實驗室，依托質譜分析平臺、免疫分析平臺、細胞生物學平臺、分子生物學平臺、病理平臺和中心實驗室服務，可提供從組織水平、細胞水平、蛋白水平到分子水平的檢測服務，可實現(xiàn)對大小分子創(chuàng)新藥物PK/PD研究的全方位支撐。陽光德美專注于解決客戶藥代藥效研究及生物分析中所遇到的挑戰(zhàn)，為國內外客戶提供國際化水準的、以臨床價值和患者需求為導向的創(chuàng)新藥項目研發(fā)服務，包括：藥代動力學生物分析服務、免疫原性生物分析服務、藥效學和生物標志物研究服務、病理檢測服務、定量藥理學研究服務和中心實驗室服務。
2. 國際標準的質量體系
實驗室的質量體系是確保檢測結果科學性、準確性和合規(guī)性的關鍵。陽光德美實驗室憑借其卓越的質量管理和技術實力，建立了符合國際標準的質量體系，為客戶提供高質量、可靠的檢測服務。陽光德美遵循GLP/GCP規(guī)范以及ICH、FDA和CFDA指導原則，已通過了中國合格評定國家認可委員會（CNAS）的認證，并積極參與國內外權威機構組織的能力驗證項目，涵蓋質譜、化學發(fā)光、酶聯(lián)免疫、臨床檢驗和病理等多個技術平臺，并均取得了優(yōu)異的成績，顯示出卓越的檢測能力和質量控制水平。
LC-MS/MS技術以其無可替代的精準性與靈活性，正推動藥物研發(fā)進入“分子級”定量時代。陽光德美憑借深厚的技術積淀與全鏈條服務能力，致力于為全球藥企提供從方法開發(fā)到申報支持的一站式解決方案。如需了解更多LC-MS/MS技術細節(jié)或定制化服務方案，歡迎聯(lián)系陽光德美生物分析團隊！
